Seqencing by ILLUMINA – Multiplexing

Тук ще направим описание на принципа на Ново Генерационно секвениране чрез синтеза на който принцип се основават всички секвенционни системи на Илумина.

Като първа стъпка е получаването на ДНК фрагменти. След като ДНК е изолирано по стандартните методи, и оценено по качество чрез специален нанофотометър, получаването на фрагменти става по механичен /при илумина чрез фокусиран ултразвук/ или ензимологичен път /При Некстера технологията / на изолираното ДНК. Получените фрагменти се блантират чрез прибавяне на екзонуклеази и се добавя по една база А, която по късно ще се свърже с прибавеният от нас адаптер. Адаптерите съдържат знайни ДНК последователности + известен индекс /бакод/, който се състои от 5 ДНК бази с които ние бележим фрагментите и които по-късно ни служат за свързване на информацията получена при секвенирането. Освен това, лигирането на тези адаптори съдържат и определена последователност към която по-късно ще се закачи секвенционният праймер от където на практика ще започне секвенирането. Чрез използването на тези знайни от нас последователности на баркодовете ние сме в състояние да миксираме различни по вид ДНК от различни интересуващи ни гени в една единствена реакция. За да рзберем какво всъщност представлява адаптера и баркода в нега е добре да проследим следващите последователни ТРИ видеа, които ще ни помогнат да разберем как именно се осъществява мултиплексната реакция на секвениране при Илумина.

 

 

 

КАКВО ПЕЧЕЛИМ ОТ ВСИЧКО ТОВА? Чрез мултиплексност ние можем да използваме пълният капацитет на секвенатора /в зависимост от моделите има различни възможности от от 1,5 (1-1.5 Gbp) милиарда базови двойки до 600 (600Gbp) милиарда базови двойки на един рън/ и да секвенираме едновременно различни по характер ДНК нопример от човек и микроби едновременно или пък до 96 различни генни участъци от различни пациенти. Всичкото това рефлектира до едно значително понижение на себестойността на реакцията достигайки рекодните 10 цента на 1 мегабаза.

 

След като подготвим фрагментите ДНК за въвеждане във флоу клетката, е редно да разгледаме какво всъщност представлява една флоу клетка на Илумина. По долната схема показва именно това.

Флоу клетката има 8 канала /писти/ по които се въвеждат подготвените ДНК-а фрагменти. Около тези писти има агарозен гел върху който са предварително залепени олига с комплементарни базови двойки на адапторите, които вече сме закачили в предишната стъпка. Милиони олига разположени в флоу клетката позволява огромна паралелна мостова амплификация, която ще разгледаме по-долу.

Така нанесените предварителни олиго-та образуват клъстери като едните са комплементарни на 3′-прим края на адапторите, тоест от единият им край, а другите са комплементарни на 5′-прим края на подготвените в предната стъпка фрагменти. По този начин въведените с последваща стъпка ДНК-а фрагменти ще се залепът по комплементарен начин за тези олига.

 

 

 

 

Схемите по-долу визуализират създаването на милиони копия оформени в клъстери чрез процеси на бридж амплификация в присъствието на полимераза, dNTP.



 

 

 

 

 

 



Наблюдавайте видеото по-долу което ще анимира процеса и ще го онагледи:

Всяка индивидуална верига върху флоу клетката се амплифицира чрез бридж амплификация. В крайна сметка се получават около 1000 копия на всяка една верига. Амплификационите копия от една верига са на фокусна позиция във флоу клетката. Тази локация се нарича имевнно “КЛЪСТЕР” При окончателното приключване на процеса имаме около 150 000 000 индивидуално четими клъстери.

 

Секвенирането се извършва чрез стандартна биохимична реакция на обратими цветови терминатори /reversible dye terminators/. Всяка една присъединяваща сеа база отделя флуорофор, който се засича от високо чувствителна ССД камера. Всяка една от четирите бази е маркирана с 4 различни цветови флуоррофора – червен, зелен,жълт и син. Камерата прави 5 снимки – една за фокусиране на клъстера и четири за всяка една от базите. Така софтуера изчислява както точната позиция на клъстерите, но така също и определя коя база е новоприсъединила се поради разлика в цветовият интензитет. Секвинирането протича в зависимост от дължината на ридовете от 35 до 100 150 базови двойки. Както стана ясно по-горе мултиплексност е възможна поради баркодиране на различни проби секвениращи се в един рън в една флоу клетка.